【专题跟踪】信号转导分子激活与阻滞

除外knockout、knockin，过表达、突变以及RNA干扰，信号分子的激动剂与阻滞剂（化合物、抗体）依然是经典公认方便的研究方法，欢迎有关同道在此跟踪、讨论、分享相关的进展。PPARδ过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR) 是一类由配体激活的核转录因子,属Ⅱ型核受体超家族成员, 存在3种亚型，即PPARα、 PPARδ、 PPARγ，这三种亚型在结构上有一定的相似性，均含DNA结合区和配体结合区等。PPAR与配体结合后被激活，与9-顺视黄酸类受体形成异二聚体，然后与靶基因的启动子上游的过氧化物酶体增殖物反应元件(peroxisome proliferator response element，PPRE)结合而发挥转录调控作用。PPRE由含相隔一个或两个核苷酸的重复序列AGGTCA组成。与配体结合后，PPAR在DNA结合区发生变构，进而影响PPAR刺激靶基因转录的能力。PPARδ几乎在所有组织中表达，浓度低于PPARα及PPARγ，直至最近以前尚未找到此一核受体的选择性配基。PPARδ是代谢综合征（肥胖、胰岛素抵抗、高血压是与脂质紊乱有关的共同的病态表现）的一个新靶点。有不少的研究表明：GW501516可作为PPARδ的特异激动剂用于研究。参考网址：>除了各种信号分子经典的阻滞剂，如PI-3K的PD*****,也有针对核膜转运的阻滞，分为非特异性的和特异性的两种。Daines等，使用detergent-sensitive factor，非特异的阻断STAT6/STAT6二聚体入核。详见下列文献：1，Daines MO, Andrews RP, Chen W, El-Zayaty SA, Hershey GK.DNA binding activity of cytoplasmic phosphorylated STAT6 is masked by an interaction with a detergent-sensitive factor. J Biol Chem. 2003 Aug 15;278(33):30971-4. Epub 2003 May 302，Andrews RP, Ericksen MB, Cunningham CM, Daines MO, Hershey GK. Analysis of the life cycle of stat6. Continuous cycling of STAT6 is required for IL-4 signaling. J Biol Chem. 2002 Sep 27;277(39):36563-9. Epub 2002 Jul 16Lisa等人，通过改变核定位分子nuclear localization signals (NLSs) 和接头分子adapters of the karyopherin-arfa/importin-arfa (Kap-arfa/Imp-arfa) family，特异的阻断inportin-beta介导的入核。详见下列文献：Lisa M. Nelson, Robert C. Rose, and Junona Moroianu. Nuclear Import Strategies of High Risk HPV16 L1 Major Capsid Protein. THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY. Vol. 277, No. 26, Issue of June 28, pp. 23958–23964, 2002wanglily0 wrote:使用detergent-sensitive factor，非特异的阻断STAT6/STAT6二聚体入核。详见下列文献：Lisa等人，通过改变核定位分子nuclear localization signals (NLSs) 和接头分子adapters of the karyopherin-arfa/importin-arfa (Kap-arfa/Imp-arfa) family，特异的阻断inportin-beta介导的入核。详见下列文献：文中的detergent-sensitive factor仅指去污剂敏感因子，具体成分是什么不知道，其作用可能是阻断了stat二聚体与DNA结合的能力，而非是阻断其入核。NLS是核定位信号，定点诱变以后不被importin识别，无法入核，严格地讲这并不是阻滞剂。WGA 倒是一种核孔介导的大分子入核的阻滞剂。见J CELL BIOL 104,189-200LMB即来博霉素，是CRM1抑制剂，可以阻断信号传导中CRM1介导的出核作用。AG490，可阻止jak磷酸化。多谢AN69 兄及时指正，多谢多谢！总结了下 screen.width-333)this.width=screen.width-333" width=507 height=329 title="Click to view full 未命名.JPG (507 X 329)" border=0 align=absmiddle>蛋白激酶CK2抑制剂的研究进展 蛋白激酶CK2抑制剂的研究进展.pdf (146.39k)曲古抑菌素（TSA），可以延长NF-KB在核内的时间，阻止NF-kB出核FK506,而非FK509，可以减少神经钙蛋白（calcineurin）对NF-AT的去磷酸化，使NF-AT 的核定位信号无法与转运蛋白结合，阻止其入核针对NPC上核孔蛋白的抗体，也可干预NPC 作用，使经过NPC的 入核作用受损biodna wrote:PPARδ过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR) 是一类由配体激活的核转录因子,属Ⅱ型核受体超家族成员, 存在3种亚型，即PPARα、 PPARδ、 PPARγ，这三种亚型在结构上有一定的相似性，均含DNA结合区和配体结合区等。PPAR与配体结合后被激活，与9-顺视黄酸类受体形成异二聚体，然后与靶基因的启动子上游的过氧化物酶体增殖物反应元件(peroxisome proliferator response element，PPRE)结合而发挥转录调控作用。PPRE由含相隔一个或两个核苷酸的重复序列AGGTCA组成。与配体结合后，PPAR在DNA结合区发生变构，进而影响PPAR刺激靶基因转录的能力。PPARδ几乎在所有组织中表达，浓度低于PPARα及PPARγ，直至最近以前尚未找到此一核受体的选择性配基。PPARδ是代谢综合征（肥胖、胰岛素抵抗、高血压是与脂质紊乱有关的共同的病态表现）的一个新靶点。有不少的研究表明：GW501516可作为PPARδ的特异激动剂用于研究。参考网址：>给bidna主任补充：PPAR家族简直可以竞争近几年的靶点之星了。关于响应元件PPRE，ppar-gamma和PPAR-alpha的是一样的，PPRE是以AGGTCANAGGTCA这样一个AGGCTA二倍体作为基本单元的，delta的有所不同。PPAR跟激动剂结合以后，跟9-顺视黄酸类X受体（RXR）组成异二聚体，分别各自结合一个AGGTCA，从而刺激靶基因转录。已经上市的PPAR激动剂药物都是gamma的，都是具有噻唑烷酮结构的化合物，比如pioglitazone, rosciglitazone，troglitazone(因肝毒性被叫停)PPAR家族主要参与脂肪代谢，并进一步参与糖代谢。目前研究显示，PPAR不仅仅是II型糖尿病的靶点，其他相关的重要疾病有高血脂，炎症（动脉粥样硬化），癌症（胃癌和脂肪癌），肥胖。这些还需要进一步研究，特别是delta的作用。方便的研究PPAR的转录激活作用，特别是高通量筛选（high highthroughput sceening）PPAR激动剂，没有比报告基因更好的方法，可以方便而灵敏的检测了。《活化T 细胞核因子(NFAT)》活化T 细胞核因子(Nuclear Factor of Activated TCells ,NFAT) 在免疫反应中对诱导基因转录起重要作用。NFAT蛋白在T 细胞及其它类型的免疫细胞中如B 细胞、NK细胞、肥大细胞、单核细胞和嗜酸性粒细胞上表达[1 ,2 ] 。NFAT 蛋白因那些与Ca2 + 动员连接受体的激活而被活化,如T 和B 细胞的抗原识别受体、肥大细胞和嗜硷性粒细胞的FcεR 等。受体的激活和Ca2 + 动员导致了许多细胞内酶包括依赖Ca2＋／钙调蛋白的磷酸脂酶Calcineurin 的活化,Calcineurin 是活化T 细胞核因子发挥作用的主要激活因子[1 ] 。受激细胞诱导一大批与活化有关的基因转录,许多基因都可能是NFAT 的靶基因,这些基因编码转录因子、信号蛋白、细胞因子、细胞表面受体和其它效应蛋白。免疫抑制药物FK2506 和环孢菌素A 通过抑制Calcineurin 可阻断3 种抗原受体通路(NFAT、NFκB和JNP) , 抑制成熟淋巴细胞增殖[3 ] 。作为Calci2neurin 的底物,NFAT 是FK2506 和环孢菌素A 主要的靶, 1 　结构已知有4 种哺乳类NFAT 基因,它们编码约含700～1000 个氨基酸残基的蛋白质。在NFAT 蛋白中,有两个相邻的非常保守的区域即NFAT 同源区(NHR , 约300 个氨基酸残基) [5 ] 和DNA 结合区(DBD ,约270 个氨基酸残基) [6 ] 。NHR 和DBD 夹在两条多肽链两端多变的转录活化区之间[7 ] 。NFAT1 的分析表明NFAT蛋白的氨基端和梭基端都含有转录活化区(TAD) 。2 　分类NFAT1、 NFAT2 、NFAT3和NFAT4 3 　调节Calcineurin 在NFAT 活化中起着十分重要的作用。NFAT 的活化有三步:脱磷酸、核易位、对DNA亲和力的提高。（1）在静止细胞中,NFAT 蛋白被磷酸化,存在于胞浆,对DNA 具低亲和力。（2）引起Ca2 + 动员的刺激物导致NFAT 的快速脱磷酸和入核;脱磷酸的NFAT对DNA 的亲和力增高。NFAT 蛋白的活化紧随Calcineurin 的活化之后,在T 细胞中,游离的Ca2 + 水平高,Calcineurin 的活性就高,NFAT1 就能在核内保持长时间的活化状态。如果去除Ca2 + 刺激物ionomycin 或加了Calcineurin 的抑制物环孢菌素A和FK506 而使Calcineurin 的活性受到抑制, 则NFAT1 在5～15 分钟内恢复磷酸化状态,并回到胞浆内,对DNA 亲和力大大降低[10 ] 。用Calcineurin 或硷性磷酸酶作用于细胞提取物可引起NFAT1DNA 结合力的提高[12 ] 。这说明磷酸化的残基直接或间接掩盖了NFAT1 中的DNA 结合区,而脱磷酸可能通过NFAT 内在构象的改变,暴露这些区域使其易于被接近。除Calcineurin 之外还有很多蛋白和信号通路可以调节NFAT。①TCR 参与的通路:TCR 交联引起的最早结果是酪氨酸激酶包括Lck 和ZAP270 的活化以及包括引起Vav 在内的许多细胞内底物的酪氨酸磷酸化,Lck 和ZAP270 的活化引起T 细胞内的Ca2 +动员[13 ] ,由此引起依赖NFAT的报告基因表达。②PMA 激活的信号通路:已知PMA 在T 细胞内的作用是激活蛋白激酶C、Ras、Raf ,（1）Ras 对于NFAT 的功能是必不可少的,活化的Ras 可以有效地代替PMA ,同基础的活化的Calcineurin 一起为依赖NFAT 的报告基因表达提供充分刺激,而显性阴性的Ras 则抑制TCR 引起的NFAT活化。Ras 有多种多样的效应蛋白如Raf 、Ras、与Ras 有关的GTP 酶Rac 和Rho 。（2）Raf 通路对于AP－1的诱导是很重要的,Raf 可以激活MEK1 (有双向活性的激酶) ,而MEK1 又可激活MAP 激酶EPK1 和ERK2。在T 细胞中,活化的Raf 和ERK1 代替PMA与ionomycin 协同刺激NFAT 驱动的转录,但不如活化的Ras 有效。同时,这些蛋白质的显性阴性形式也仅部分抑制Ras 介导的活化。（3）另一种Ras 的效应蛋白的活性形式Rac21 ,可通过不含ERK的通路最大限度地激活,AP－1 驱动的报告基因的表达,即使是与ionomycin 或活化的MEK1 联合以后也是如此。综上,说明T 细胞中存在另一条Ras 效应蛋白通路并为最大限度地表达NFAT:AP21 驱动的报告基因所需[15 ] 。关于这条通路目前还不清楚。③与Ca2 +动员有关的通路: [Ca2 + ]i 的增加可激Calcineurin ,也可导致其它依赖Ca2 +／钙调蛋白激酶的激活。其中,两种有多种功能的激酶(CaMK) 可以调节NFAT的活性。在T 细胞中CaMKⅡγβ能部分抑制人Jur／ket 细胞中NFAT和AP21 驱动的报告基因表达,且抑制活化Calcineurin 加强IL22 启动子功能[16 ] 。而活化的CaMKIVPGγ具有相反作用,通过激活AP21 大幅度地加强NFAT 活性。CaMKIVPGγ通过上调血清反应因子(SRF) 的转录功能和随后的c2Fos诱导引起NFAT活性加强且不被显性阴性形式Ras 抑制。这两种CaMKs 的相反作用与它们对不同细胞内底物的靶作用有关[17 ] 。4 　功能细胞因子基因调节区中的NFAT 结合部位可分为Ⅰ类(Group Ⅰ) 和Ⅱ类( Group Ⅱ) 。Ⅰ类包括在该位点上NFAT 蛋白能与AP21 或其它bZIP 蛋白形成协同复合体的位点。Ⅱ类包括那些通常的Rel 家族蛋白结合位点和与其相似的位点。NFAT 通过与多种细胞因子基因调节区中多种NFAT 结合部位结合引起共转录。NFAT 蛋白的DBD 可能与Rel 家族蛋白的DBD 三维结构相似,并用相应的环与DNA建立接触[6 ] 。NFAT蛋白在结合DNA 和使转录活化时表现出与AP21 协同的能力,NFAT和AP21 的协同见于许多不同细胞因子的增强子P启动子。在由Fos 和Jun 的bZIP 成分,人NFAT1 的RHR 和含鼠IL22 启动子远端ARRE2 序列DNA 片段形成的一种晶体化四元复合物中,NFAT 和AP21 间有一延伸的接触面,NFAT的DBD 和AP21 的bZIP 成分结合并和DNA 组成一紧密复合体,NFAT 和AP21 的接触表面形成了一个能识别15 个硷基对的沟[18 ] 。NFAT 和AP21 在DNA上接触邻近位点且包含两种转录因子的DNA2蛋白复合体较仅含一种蛋白的复合体具有更大的稳定性和亲和力。细胞因子基因的每个调节区域包含3～5 个结合NFAT 的部位,总长度在200～300 个硷基对,表明有效的转录需包含NFAT 复合体之间高度有效的协同。许多系统中的转录激活需要一个协同的转录复合体的有序集合,包括转录因子、协同激活因子和核心转录结构。NFAT位点的序列相对其它有关转录因子位点的排列有很大的可变性,这就决定了其诱导基因表达的特异性,如NFAT 和Oct 蛋白在IL22 和IL24 启动子上的相互作用,前一种为协同关系,后一种为争关系。很可能特定的NFAT 蛋白和在不同类型细胞中表达的协同转录因子,或是介导这些转录因子和基础的转录复合物间相互作用的细胞特异的核协同刺激因子或抑制因子决定选择性的基因表达。NFAT1 基因裂解导致无DNA 结合活性蛋白表达[19 ]甚至无蛋白表达[20 ] 。NFAT1 缺陷鼠除有一定程度脾肿大外,发育和免疫正常。但某种初次和再次免疫应答显著增强,在至少3 种实验环境中有发展为TH2 反应的倾向:过敏炎症活体模型中检测到嗜酸性粒细胞在胸膜内的数目增加和血浆IgE 水平升高[20 ] ;用TNP2卵白蛋白免疫接种时,血浆IgE 水平升高;试管内受IL24 和抗CD3 刺激的脾细胞更易向TH2 表现型分化。在正常鼠,NFAT1 的活化可以诱发某些细胞内抑制因子或细胞表面受体表达,或减弱活化效应蛋白表达,从而减弱免疫反应强度,并可能限制TH2 型细胞因子后期表达,而NFAT1 缺陷鼠可能引起早期细胞因子的变化而改变后期细胞因子的平衡,从而改变总体反应的类型[19 ] ;或有另一种与NFAT1 抗衡的NFAT蛋白支持TH2 型细胞因子基因转录。综上,NFAT1 的表达和功能缺陷与过敏性疾病的发生有很密切的关系。另外,编码所有4种NFAT 蛋白的mRNA 在睾丸和P或卵巢中及在骨骼或心肌细胞中均有表达,这表明NFAT 可能在生殖和肌肉发育及其功能发展中起作用。《090　钙调神经磷酸酶和N FA T 在T 细胞活化中的作用》　T 淋巴细胞活化机制是现代免疫学重要命题之一, 从TCR 接受A PC 提供的抗原信息到T 细胞基因活化并开始增殖或产生细胞因子是一个复杂而精细的过程, 其间涉及诸多信号转导分子的相互作用。已知N FA T 是T 细胞基因活化的关键信号元件之一, 而N FA T 作用的发挥又依赖于CaN 的作用。近年来有关CaN 和N FA T 在T 淋巴细胞激活过程中的作用及其机理得到了广泛研究, 并取得较大进展, 现简要综述如下。一、钙调神经磷酸酶CaN 是目前所知的唯一依赖于Ca2+ .钙调素的Ser.T h r 磷蛋白磷蛋白酸酶, 在分类上属于磷蛋白磷酸酶22B (PP22 , 70 年代末80 年代初由加拿大籍华人王学荆教授, 美籍华人张槐耀教授及美国的Klee 教授的实验室分别在猪脑中发现并纯化成功, 由于它结合CaM 并且在动物神经元中大量存在, Klee 将其命名为Calcineu rin, 我们将它汉译为钙调神经磷酸酶。CaN 是一个由61KD 的A 亚基和19KD的B 亚基组成的异二聚体,A 亚基(CaNA ) 为催化亚基, 与CaM 结合; B 亚基(CaN 为调节亚基, 与Ca2+ 结合。生物化学和遗传学研究表明, CaNA 由5 个不同结构域组成: N 2末端区,催化区, CaNB 结合区, CaM 结合区及自抑制区(au to2inh ib ito ry,A I) ; CaNB 结合4 个Ca2+ ,与CaM 的序列有33235% 的同源性, 其二级结构与CaM 很相似。CaN 的磷酸酶活性由Ca2+结合CaNB 和CaM 结合CaNA 激活。此外,CaN 的活性还需要二价金属离子如M n2+ 和N i2+ 的存在[ 1 ]。CaN 是保守蛋白, 广泛分布于真核生物中, 从大鼠, 小鼠, 猪, 蛙, 鱼和鸡的脑匀浆中以及人和兔的非神经组织中均检出了CaN , 在原生动物门的草履虫中也有发现[ 2 ]。非神经组织中的CaN 含量仅为神经组织中的1ö2021ö10。免疫组织化学定位实验证明, CaN 主要存在于突触密度区和树突密度区, 且酶量的变化与突触形成有关。亚细胞定位研究表明, CaN 在细胞浆和膜组分中的含量较高[ 3 ]。由此可见, CaN对脑的功能, 尤其对突触活动具有重要作用。CaN 能催化多种SeröT h r 残基已磷酸化的蛋白进行脱磷酸化, 并具有显著的底物特异性, 不同来源的CaN 在底物特异性上并无差别。已知的CaN 底物蛋白包括活化T 细胞核因子(N FA T )、酪蛋白(casein)、组蛋白(h istone)、鱼精蛋白( p ro tam ine )、卵黄高磷蛋白(pho svit in)、依赖于cAM P 的蛋白激酶2 的调节亚基、MA P22、tau 蛋白以及四种哺乳动物脑内磷蛋白如DARRP232、G2底物、蛋白K2F 和突触素I(Synap sin I)。此外, CaN 还能作用于一些非蛋白类底物, 主要是烯醇磷酸化合物, 如PN PP、pho spho tyro sine 等。与蛋白类底物比较, 在酶动力学上, 它们与CaN 反应时均具有较高的Km 和Vm ax。1991 年, L iu 等[ 4 ]发现免疫抑制剂环孢菌素A (Cyclo spo rin A , CsA ) 和FK506 与其各自的胞内受体Cycloph ilin (CyP) 和FK5062b ind2ing p ro tein 12 (FKBP12) 结合后, 抑制细胞因子如IL 22 的表达, 从而抑制T 细胞分泌颗粒的胞吐作用。CyP 和FKBP12 具有异构酶活性。在体外, CsA 2CyP 或FK5062FKBP12 复合物在Ca2+ 存在下特异结合并抑制CaN 酶活。通过对CsA 和FK506 类似物的研究表明, CaN磷酸酶活力的抑制与T 细胞抑制具有极好的相关性, 由此提示CaN 是TCR 信号转导中的一个关键酶。二、活化T 细胞核因子(N FA T )N FA T 是T 淋巴细胞受抗原刺激后产生细胞因子如IL 22 所需的转录因子, 在免疫应答期间细胞因子基因转录调控中起着重要作用,其分子量约为120KD。在细胞核内, 它通过作用于一些细胞因子基因启动子中的顺式作用元件而调控细胞因子的基因表达。目前已报道的N FA T 家族有4 个成员, 即N FA T 1 (N FA Tp ) ,N FA Tc, N FA T 3 和N FA T 4 ( NA FTxöN FA Tc3)。根据相似性程度,N FA T 蛋白可分为3 个结构域。①长约400 个氨基酸残基的N 端结构域, 它是由9 个保守结构基元(mo t if) 的同源片段组成的、中等相似(23～ 35% 相似) 的序列, 称为N FA T 同源区(NHR ) [ 5 ] , 并包括3 个保守SP 框(SP BOX) 的拷贝; ②约300 个氨基酸残基的中央结构域, 它是N FA T 中相似性最高(66～ 73% 相似) 的序列, 与转录因子Rel 家族的DNA 结合区有微弱联系, 故被称为Rel 相似区(RSD ) [ 6 ]; ③长约250～ 350 个氨基酸残基的C 端结构域, 除一个存在于每一N FA T 剪接突变体中的长约15 个氨基酸的序列外, 此区相似性最低。N FA T 1 的DNA 结合能力依赖于其中央结构域RSD。对N FA Tx 的一个剪接突变体N FA Tx1 的研究也得到类似结果, 缺乏SRD 突变体均不能结合DNA。N FA T 的最大量表达至少需要2 个信号, 即PKC 激活和Ca2+ 浓度上升, 而N FA T 任一结构域的缺失均降低其受PMA 和Ca2+ 载体A 23187 诱导的转录活化能力, 这说明在N FA T 的N 端和C 端均存在完整转录活化所需的序列。但有趣的是, 转染缺失N 端N FA Tx1 的突变体pM E2X△N 时, 仅PMA 刺激即可导致明显的N FA T 活力(但只有PMA 2A 23187 联合刺激时的1.3) , 且该活力不受CsA 的抑制。这说明N FA Tx1 包含一个受Ca2+ 2CaN 依赖性途径调控的N 端抑制区。这个受CaN 调节N 端抑制区被称为CR I 结构域( calcineu rin2regu lato ry inh ib ito ry dom ain )。NA FT 家族成员在T 细胞发育的不同阶段有不同的调节作用[ 7 ]。N FA Tx 的mRNA 在所有T 细胞亚群中都有表达, 而在双阳性(CD4+CD8+ ) 胸腺细胞中表达最高。相反,N FA T 1 的mRNA 主要在成熟的CD4+ 的单阳性细胞中表达。N FA Tc 的mRNA 在所有T 亚群中均很低, 但沸波酯等可强烈诱导其表达。即PKC 激活和Ca2+ 浓度上升, 而N FA T 任一结构域的缺失均降低其受PMA 和Ca2+ 载体A 23187 诱导的转录活化能力, 这说明在N FA T 的N 端和C 端均存在完整转录活化所需的序列。但有趣的是, 转染缺失N 端N FA Tx1 的突变体pM E2X△N 时, 仅PMA 刺激即可导致明显的N FA T 活力(但只有PMA 2A 23187 联合刺激时的1ö3) , 且该活力不受CsA 的抑制。这说明N FA Tx1 包含一个受Ca2+ 2CaN 依赖性途径调控的N 端抑制区。这个受CaN 调节N 端抑制区被称为CR I 结构域( calcineu rin2regu lato ry inh ib ito ry dom ain )。NA FT 家族成员在T 细胞发育的不同阶段有不同的调节作用[ 7 ]。N FA Tx 的mRNA 在所有T 细胞亚群中都有表达, 而在双阳性(CD4+CD8+ ) 胸腺细胞中表达最高。相反,N FA T 1 的mRNA 主要在成熟的CD4+ 的单阳性细胞中表达。N FA Tc 的mRNA 在所有T 亚群中均很低, 但沸波酯等可强烈诱导其表达。三、CaN 和N FA T 在T 细胞激活中的作用A PC 提供的抗原—MHC 复合体与T 细胞表面TCR 蛋白结合代表着T 细胞活化过程中的主信号。而A PC 膜分子B7 与T 细胞表面的CD28 分子结合为T 细胞活化所必需, 称为协同刺激信号。这些细胞—细胞间的相互作用相当复杂, 一方面包括大量的膜受体与其配体(或称反受体, coun ter2recep to r) 相互作用; 另一方面诸多自泌的或旁泌的细胞因子与其特异膜受体相互作用。主信号通过磷脂酰肌醇通路,首先活化磷脂酶C (PLC) , PLC 使4, 5 二磷酸磷脂酰肌醇(P IP2 ) 断裂成1, 4, 5 三磷酸肌醇( IP3) 和二酰肌甘油(DA G)。IP3 引起钙从钙库中释放到细胞溶质中, 通过CaN 和CaM 活化N FA T、N FJB、A P21 和O ct21 等核因子, 使IL 2 基因表达。DA G 则通过活化PKC 而激活上述的核因子。对于大部分T 细胞而言, IL 22 都是自泌性生长因子, 也是活化T 细胞进入增殖和分化阶段的重要条件。T 细胞的增长由IL 22 控制, IL 22 表达升高, 则促进T 细胞活化。有证据表明,IL 22 的表达依赖于N FA T 的表达, 而N FA T的活化又与脱磷酸化有关。存在于胞浆中的N FA T 亚基自身磷酸化, 是CaN 的作用底物,且CaN 催化的脱磷酸化作用受CsA 和FK506的抑制。1992 年, O ’Keefe 等证明[ 8 ] , 在转染CaN的细胞中, 在PMA 和Ca2+ 载体刺激下, IL 22驱动的基因表达提高约2 倍, 而过表达组成型活跃的CaN 突变体(去掉自抑制区和CaM 结合区) 的细胞中, 仅PMA 存在即提高约150倍, 这说明活跃的CaN 可代替基因表达对Ca2+ 载体的需要。Clip stone 等[ 9 ]也获得类似的结果。由此可见, CaN 的过表达产生对CsA 和FK506 的抵抗作用, 同时提高N FA T 和N F IL 22A 依赖性转录, 提高了Ca2+ 和PKC 刺激下T细胞的活化。CaN 在此过程中起关键作用, 即CaN 是T 细胞活化的关键酶。新近的研究证明[ 10 ] , Tp l22 激酶也可激活N FA T 而诱导IL 22表达, 这种激活作用依赖于CaNöN FA T 通路和MA PK (m itogen2act ivated p ro tein k inase )通路。对N FA T 4.x 1[ 11 ]和N FA T 1 的研究发现,在SDS2PA GE 中, 此两种N FA T 的迁移变化与其N 端结构域有关, 说明N FA T 的N 端可能是其(脱) 磷酸化位点; 而免疫共沉淀实验和转染实验也均发现N 端N FA T 结构域是CaN靶位点。N FA T 的CaN 靶位点是一段短的保守序列, 其中一个氨基酸残基改变都会影响CaN介导的脱磷酸化和核转位作用[ 12 ]。Lou 等[ 13 ]发现, 细胞受刺激时, CaN 结合N 端N FA T 1 (1～415) ,N FA T 1 被磷酸化并随之进入细胞核; 而对于N FA Tx1, CaN 不仅结合其氨基端, 且通过多个N FA Tx l 停靠位点而结合。N FA Tx l 中包含CaN 活性靶的146～ 310 区段的序列已被确定。此外, CaN 与N FA Tx1 氨基端结合, 可使N FA Tx1 的CR I 特定氨基酸脱磷酸化, CR I 的抑制活力丧失, 从而活化N FA Tx1 转录。CR I图谱已在着手进行, 现已确定SP 框前的约60对N FA T 4öx 1[ 11 ]和N FA T 1 的研究发现,在SDS2PA GE 中, 此两种N FA T 的迁移变化与其N 端结构域有关, 说明N FA T 的N 端可能是其(脱) 磷酸化位点; 而免疫共沉淀实验和转染实验也均发现N 端N FA T 结构域是CaN靶位点。N FA T 的CaN 靶位点是一段短的保守序列, 其中一个氨基酸残基改变都会影响CaN介导的脱磷酸化和核转位作用[ 12 ]。Lou 等[ 13 ]发现, 细胞受刺激时, CaN 结合N 端N FA T 1 (1～415) ,N FA T 1 被磷酸化并随之进入细胞核; 而对于N FA Tx1, CaN 不仅结合其氨基端, 且通过多个N FA Tx l 停靠位点而结合。N FA Tx l中包含CaN 活性靶的146～ 310 区段的序列已被确定。此外, CaN 与N FA Tx1 氨基端结合, 可使N FA Tx1 的CR I 特定氨基酸脱磷酸化, CR I 的抑制活力丧失, 从而活化N FA Tx1 转录。CR I图谱已在着手进行, 现已确定SP 框前的约60个残基。此区缺失时, 对Ca2+ 传递的依赖性可部分被克服。N FA T 1c 也有类似情况[ 14 ]。N FA T 1 活化的早期事件包括其迅速脱磷酸化、与DNA 上N FA T 位点亲和力增强及进入核内, 这三个过程都与CaN 有关, 因为它们均能被CsA 和FK506 阻断。CaN 与N FA T 4.x1 的N 末端结合并与之形成复合物转移到核内, 而入核运输必然发生在DNA 结合和转录活化之前。N FA Tx.4 以依赖于CaN 的方式转移至核内[ 13 ]。持续高浓度的Ca2+ , 而非瞬时的Ca2+ 脉冲对于维持N FA T 停留在核内是必须的。在核内,N FA T 依赖于Ca2+ , 诱导淋巴细胞活化和增殖所需的基因进行转录[ 15 ]。T 细胞应答被认为是依赖于一个域值量TCR 的活化[ 16 ] , 此域值与Ca2+ 迁移持续时间有关。仅当一特定域值的Ca2+ 持续运动, 结合并活化CaN , 后者使N FA T 的CR I 功能丧失时,N FA T 蛋白才与之应答而参与此调控。此时, 控制可迁移Ca2+ 的数量和持续时间可决定N FA T 蛋白是否具有转录活化能力。个残基。此区缺失时, 对Ca2+ 传递的依赖性可部分被克服。N FA T 1c 也有类似情况[ 14 ]。N FA T 1 活化的早期事件包括其迅速脱磷酸化、与DNA 上N FA T 位点亲和力增强及进入核内, 这三个过程都与CaN 有关, 因为它们均能被CsA 和FK506 阻断。CaN 与N FA T 4öx1 的N 末端结合并与之形成复合物转移到核内, 而入核运输必然发生在DNA 结合和转录活化之前。N FA Txö4 以依赖于CaN 的方式转移至核内[ 13 ]。持续高浓度的Ca2+ , 而非瞬时的Ca2+ 脉冲对于维持N FA T 停留在核内是必须的。在核内,N FA T 依赖于Ca2+ , 诱导淋巴细胞活化和增殖所需的基因进行转录[ 15 ]。T 细胞应答被认为是依赖于一个域值量TCR 的活化[ 16 ] , 此域值与Ca2+ 迁移持续时间有关。仅当一特定域值的Ca2+ 持续运动, 结合并活化CaN , 后者使N FA T 的CR I 功能丧失时,N FA T 蛋白才与之应答而参与此调控。此时, 控制可迁移Ca2+ 的数量和持续时间可决定N FA T 蛋白是否具有转录活化能力。激酶与磷酸酶在N FA T 多个残基上相互作用。无论磷酸化或非磷酸化形式的N FA Tp均结合CaN , 且此结合均可由于FK5062FKBP12 复合物预处理CaN 而阻断。一旦CaN 2FKBP122FK506 复合物形成, 活化或非活化T 细胞中的N FA Tp 均不能再于CaN 结合[ 17 ]。但在体外, 一旦N FA Tp 与CaN 作用, 外加的FK5062FKBP12 复合物则不能破坏这一作用。FK5062FKBP12 复合物抑制结合CaN 的底物, 而非影响CaN 的磷酸酶活力。CaN 不仅通过使N FA T 特定残基脱磷酸化以活化N FA T 进入细胞核, 后者通过结合DNA 和转录活化以激活IL 22 的基因表达, 还可间接作用于其他一些细胞因子。T sub io 等[ 18 ]曾发现组成型活跃的CaN 与PKC 或N FJB.A P21 协同作用可以活化粒细胞.巨噬细胞集落刺激因子(GM 2CSF) 启动子的转录。在T 细胞激活的下游,N FJB、A P21 和N FA T 结合序列是通过PKC 和Ca2+ 信号转导诱导GM 2CSF 基激酶与磷酸酶在N FA T 多个残基上相互作用。无论磷酸化或非磷酸化形式的N FA Tp均结合CaN , 且此结合均可由于FK5062FKBP12 复合物预处理CaN 而阻断。一旦CaN 2FKBP122FK506 复合物形成, 活化或非活化T 细胞中的N FA Tp 均不能再于CaN 结合[ 17 ]。但在体外, 一旦N FA Tp 与CaN 作用, 外加的FK5062FKBP12 复合物则不能破坏这一作用。FK5062FKBP12 复合物抑制结合CaN 的底物, 而非影响CaN 的磷酸酶活力。CaN 不仅通过使N FA T 特定残基脱磷酸化以活化N FA T 进入细胞核, 后者通过结合DNA 和转录活化以激活IL 22 的基因表达, 还可间接作用于其他一些细胞因子。T sub io 等[ 18 ]曾发现组成型活跃的CaN 与PKC 或N FJBöA P21 协同作用可以活化粒细胞ö巨噬细胞集落刺激因子(GM 2CSF) 启动子的转录。在T 细胞激活的下游,N FJB、A P21 和N FA T 结合序列是通过PKC 和Ca2+ 信号转导诱导GM 2CSF 基因表达所必须的。CaN 也是通过活化N FA T 而促进GM 2CSF 基因表达。此外, 研究表明, 免疫抑制剂CsA 和FK506 通过抑制T 细胞活化中的早期事件而阻止一些细胞因子的转录。这些细胞因子除IL 22、GM 2CSF 外, 还有IL 23、IL 24、TN F2A以及其它一些在协同免疫应答中起主要作用的分子。CaN 是药物—受体复合物的特异靶酶, 而N FA T 蛋白则可能是CaN 和免疫抑制剂的主要靶分子。由此可见, CaN 通过作用于N FA T 蛋白而调控T 细胞活化时不同细胞因子的基因表达, 因而对T 细胞激活至关重要。转贴请注明出处！阻断剂小结 阻断剂.ppt (61.5k)我也总结一下关于阻断剂和抑制剂：U0126：阻断ERK MAPK信号通路SB253080：阻断p38 MAPK信号通路SP600125：JNK抑制剂LY294002: PI3K抑制剂Calphostin C(钙磷酸蛋白C): PKC抑制剂NAC: 抑制NF-kB活化s-methylisothiourea(S-甲基异硫脲): 抑制iNOS氨基胍：糖基化产物形成的抑制剂BSO：GSH合成的抑制剂BHA: 人工合成的抗氧化剂二亚苯基碘: NADPH氧化酶抑制剂proteasome inhibitor: MG132, LLnL(MG101)主要用在研究蛋白由多聚泛素化引起的降解的研究PD 098059, MEK 1,2 抑制分子,GM6001是MMP9的特异性抑制分子谢谢你们！这边风景依旧红火这边风景依旧红火建议，不要单单写这些东西，写上你的依据，比如从那得到这些信息，最好是引文》好建议幅度所附PAK2阻滞剂是什么，那买？多谢我想做小鼠巨噬细胞感染后凋亡的阻滞，用RNAi阻滞，我问公司他们说只有人的载体，没鼠的，不知PAK2阻滞位点在那，引物如何设计da***ao wrote:PAK2阻滞剂是什么，那买？多谢Staurosporine，sigma有。>特异的RNAi序列可以自己设计、查文献等，可以合成或装载体转录。斑竹真够意思，thank you very ,祝你happy enough.upa (尿激酶型纤溶酶原激活物):丝氨酸蛋白酶fak(粘着斑激酶):酪氨酸蛋白酶谁知道他们的抑制剂?谢谢!有谁知道Smad信号系统阻断剂？多谢！应该补充该抑制剂作用的机理。核心文献和主要生产厂家。wortamin:胰岛素信号通路PI3K的inhibitor.AICAR(5-aminoimidazole-4-carboxamide- b-D-ribofuranoside ):近几年比较火的AMPK(AMP-activated protein kinase (AMPK))的activator.Boc-d-FMK:广谱的caspase的inhibitor. PD98059 、 U2106:特异性的 MEK1/2 inhibitors,yigehaoren wrote:wortamin:胰岛素信号通路PI3K的inhibitor.AICAR(5-aminoimidazole-4-carboxamide- b-D-ribofuranoside ):近几年比较火的AMPK(AMP-activated protein kinase (AMPK))的activator.Boc-d-FMK:广谱的caspase的inhibitor. PD98059 、 U2106:特异性的 MEK1/2 inhibitors,楼上的兄弟头像挺帅的啊：）各位看官，我问一个弱弱的问题，研究信号转导的一个途径究竟能说明什么问题，现在各个信号途径之间的crosstalk究竟有多大意义？麻烦高手解释则个。Tg（毒胡萝卜内酯）Ca2+激活剂SNAP Ca2+抑制剂我来一张实在的好图 screen.width-333)this.width=screen.width-333" width=640 height=483 title="Click to view full kluhgkjhlkjlk'jl.JPG (687 X 519)" border=0 align=absmiddle>关于中性粒细胞呼吸爆发通路的信号转导分子激活与阻滞，请参考附件我们研究了300J/m2低强度He-Ne激光诱导牛中性粒细胞产生呼吸爆发的信号通路。用化学发光法测量激光诱导中性粒细胞在体外呼吸爆发，用genistein等胞内信号转导分子活性抑制剂研究产生这一效应的信号转导途径。实验发现，酪氨酸蛋白激酶（PTKs）抑制剂genistein完全抑制了这一效应，磷脂酶C（PLC）抑制剂U-73122和蛋白激酶C（PKC）抑制剂calphostin C 部分抑制了这一效应。实验结果表明，PTKs在诱导呼吸爆发过程中起重要作用；[PTKs-PLC-PKC-NADPH氧化酶]这一信号转导途径可能参与了激光诱导呼吸爆发产生的过程。 Duan 29-174-178 2001.pdf (109.75k)shexiang wrote:有谁知道Smad信号系统阻断剂？多谢！我也需要。。。